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細胞培養實驗技術匯總(四)

 二維碼 233
2016-11-18 細胞之邦

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目錄:

第五章 常見組織細胞的培養方法

含 第一節 上皮細胞培養

   第二節 內皮細胞培養

   第三節 神經細胞培養

   第四節 肌組織細胞培養

   第五節 巨噬細胞培養

   第六節 腎小球分離、移植培養

   第七節 裸小鼠移植瘤單細胞分離培養

第六章 腫瘤細胞的培養

含 第一節 組織培養腫瘤細胞生物學特性

   第二節 培養方法

   第三節 成纖維細胞排除法

   第四節 提高腫瘤細胞培養存活率和生長率措施

   第五節 體外培養腫瘤細胞生物學檢測

   第六節 對腫瘤細胞系或細胞株的評價


第五章 常見組織細胞的培養方法

體內組織細胞在體外培養時,所需培養環境基本相似,但由于物種、個體遺傳背景及所處發育階段等的不同,各自要求條件有一定差別,所采取的培養技術措施亦不盡相同,現介紹個別組織細胞培養的要點如下:

第一節 上皮細胞培養

上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分,又由于癌起源于上皮組織,故上皮細胞培養特別受到重視。但上皮細胞培養中常混雜有成纖維細胞,培養時生長速度往往超過上皮細胞,并難以純化,同時上皮細胞難以在體外長期生存,因此純化和延長生存時間是培養關鍵。

體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜,因此培養在有膠原的底物上可能利于生長,另外人或小鼠表皮細胞培養在以3T3細胞為飼養層(用射線照射后)時,細胞易生長并可發生一定程度的分化現象。降低PH、Ca2+含量和溫度,向培養基中加入表皮生長因子,均有利于表皮細胞生長。

以表皮細胞為例,用皮膚表皮和真皮分離培養法可獲得純上皮細胞,其法如下(黑木凳志夫 1981)

1、取材:外科植皮或手術殘余皮膚小塊,早產流產兒皮膚更好,取角化層薄者,切成0.5-1平方厘米小塊。

2、置0.02%EDTA中,室溫,5分鐘。

3、換入0.25%胰蛋白酶中,4℃過夜。

4、分離:取出皮塊,用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。

5、取出表皮,剪成更小的塊后,置0.25%胰酶中,37℃,30—60分鐘。

6、反復吹打,制成懸液。

7、培養:用80目不銹鋼紗網濾過后,低速離心,吸去上清。

8、直接加入培養基(Eagle加20%小牛血清)制成細胞懸液,接種入培養瓶,CO2溫箱培養。


第二節 內皮細胞培養

內皮細胞易于從大血管分離培養成單層細胞,對于研究內皮細胞再生、腫瘤促血管生長因子(TAF)等有很大價值。

研究人內皮細胞培養以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡便,其法如下:

1、產后新鮮臍帶,無菌剪取10—15厘米長一段,如不能立即培養,可于12小時內保存于4℃。

2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血,在入口處用線繩扎緊,以防液體返流。

3、用血管鉗夾緊臍帶一端,從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶,充滿血管,消化3—10分鐘;注入口用線繩扎,以防液體返流。

4、吸出含有內皮細胞的消化液,于離心管中,注入溫PBS輕輕反復沖洗后,一并注入離心管中(此步驟可重復)。

5、離心去上清,加入RPMI1640培養液制成細胞懸液,接種入培養器皿中,置溫箱培養。兩至三天可見細胞長成單層。


第三節 神經細胞培養

神經細胞(神經元)不易培養,只有在適宜情況下,如接種在膠原底層上,或加入神經生長因子和膠質細胞因子時,可出現一定程度的分化,長出突起等現象,但很難使之增值。而神經膠質細胞是神經組織中比較容易培養的成分。

人、鼠等腦組織即可用于神經膠質細胞培養,不僅能獲得生長的膠質細胞,也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來,膠質細胞在培養中生長不穩定,不易自發轉化,但對外界因素仍保持很好的敏感性,可用ROUS病毒和SV4等誘發轉化。

一、設備: 無菌操作設備。

二、大型設備CO2 培養箱:恒溫5%、10%CO2維持培養液中pH值。

倒置顯微鏡:用于每天觀察貼壁細胞生長情況。

解剖顯微鏡,用于準確地取材。

常溫冰箱:-4℃,用于保存各種培養液,解剖液和鼠尾膠。

低溫冰箱:-20℃--80℃,用于儲存血清酶,貴重物品和試劑。

電熱干烤箱:用于消毒玻璃器皿。

高壓消毒鍋:用于消毒培養皿,手術器械。

過濾器:配制解剖液、培養液,必須過濾后才可使用,以去除細菌。

滲透壓儀,pH劑,天平等。

三、培養器皿及手術器械

1、培養皿:常用35mm塑料及玻璃皿,解剖取材用15mm-90mm直徑。

2、培養板,24-40孔,可用于開放培養。

3、培養瓶:

4、吸管,常用1,5,10ml,均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。

5、各類培養液貯存器。

6、小型手術器械。

準備:

1、配制培養液

(1)解剖液:以無機鹽(去除Ca2+ , Mg2+)加葡萄糖配制成PBS緩沖液,保持一定的滲透壓和pH值。

(2)基礎培養基(MEM):主要為多種氨基酸,加入葡萄糖,雙蒸餾水溶解。

(3)接種培養液:用于胰酶消化后的細胞分散,做成細胞懸液,其成分為MEM含1%谷氨酰胺,另加入10%馬血清,當天配制。

(4)維持培養液:接種后24h,全部換成此液,后每2周換一次,每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清,1%谷氨酰胺,及適量的支持性營養物質。

2、培養基質 常用鼠尾膠、小牛皮膠,多聚賴氨酸,再涂膠

3、消毒培養皿的備用。所有培養器皿均需清水沖洗2-3d,達兩次ddH2O,每遍洗刷3-4次,加塞包裝,置于烤箱中干燥消毒,于培養前1天進行。

神經細胞分散培養

(一)選材  常用胚胎動物或新生鼠神經組織。雞胚常用胚齡6-8d,新生鼠或胎鼠(12-14d)或人胚胎。不過也有認為與組織相關。如大白鼠胚胎以19d為宜,小鼠 以18d為宜,大鼠紋狀體以10d為宜;若紋狀體與黑質聯合培養的大鼠胚,則黑質以13d,紋狀體18-21d為宜;小腦以20-21d小鼠胚胎,所獲蒲 氏細胞成活率高,顆粒細胞正在分化;脊髓與DRG聯合培養,常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎,取材易,神經成活率高。

(二)取材。腦則取出相應組織,在解剖液中先剪碎,以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上,用小刀將其要成背腹兩側,分別培養。

(三)細胞分離與接種。神經組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min,移入接種液,停止消化,并洗去胰蛋白酶液,用細口吸管吹打細胞懸液,使其充分分散,如此多次,待沉淀后吸出上層細胞懸液,計數,預置細胞密度,接種于培養皿(1×106),做電生理應為5×105或更低。

(四)抑制膠質細胞生長。培養3-5d后,也有人認為培養7d后,用阿糖胞苷,或5-FU抑制神經膠質細胞的生長。

(五)觀察。接種6-12h,開始貼壁,并有集合現象,細胞生長突起明顯,5-7d膠質細胞增生明顯,7-10d膠質細胞成片于神經細胞下面,形成 地毯,2周時神經細胞生長最豐滿,四周暈光明顯,一個月后,有些神經細胞開始退化,變形,甚至出現空泡,一般培養2-4周最宜。

但神經細胞只能增大,而不能增殖,只能原代,不能傳代,不會有細胞周期,而且隨培養時間的延長,細胞數量在下降,但膠質細胞可以,神經膠質細胞也可 以。在培養過程中,早期9-12d時,有較多的神經細胞死亡,這是第一次死亡階段,應注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細胞一般突起長而多,且相互 形成突觸。

(六)常用培養細胞實驗有:FCM的蛋白總量分析;膜片鉗與離子通道的分析;免疫組化分析;

但免疫組化分析應注意,由于抗體直接作用于活細胞,不易穿透活細胞,故對核內抗原定位時,首先考慮膜對抗體的通透性問題。常用化學試劑以增加其通透性或采用冰凍方法解決。

在免疫組化中,或其它組織學染色中,常用不同的染色方法以區分不同細胞,如半乳糖腦苷脂對小樹突膠質細胞標記明顯;GFAP對星形膠質細胞具有特異 性染色等。這對研究神經系統中膠質細胞功能具有極大的應用價值。神經膠質細胞以往多被忽視,其在腦血管疾病(如缺血性損傷)、退行性疾病(如AD、 PD)、損傷后膠質細胞的填充等具有不可忽視的作用。它也是神經細胞功能和營養支持的物質基礎。

第四節 肌組織細胞培養

各種肌組織均可用于培養,以心肌和骨骼肌較實用。

(一)骨骼肌細胞培養

1、出生1一2天的乳鼠,引頸處死。

2、無菌取大腿肌組織,切成0.3一0.5cm2小塊后,用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化,無菌紗網或紗布濾過。

3、計數調整細胞密度。

4、快接種量2×106/皿入培養基培養。

5、培養基內含10%小牛血清,可加1%的胎汁以促進分化。

接種在膠原或膠原的底物上能促進細胞分化,明膠配置:用Hanks液配成0.01%明膠。

該細胞接種率約50%,細胞生長開始呈紡錘形,培養50-52小時后出現融合形成肌細胞狀多核纖維。數日后融合停止,此時可觀察到橫紋,一般在融合后二、三天內能見到收縮現象。

(二)心肌細胞培養

心肌細胞是最早的培養材料,Carrel曾長期培養過心肌組織,至今心肌仍不失為好的培養物,最常用的是雞胚心肌。

心肌比較容易培養和生長,可用懸滴培養、組織塊培養和消化培養法,均可獲良好的效果。取心室肌培養較好,原代培養的雞胚心肌呈紡錘形,培養成功時,一周后可見節律性收縮現象。

第五節 巨噬細胞培養

巨噬細胞屬免疫細胞,有多種功能,是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。巨噬細胞容易獲得,便于培養,并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群,在條件適宜下可生活2-3周,多用做原代培養,難以長期生存。

巨噬細胞也建有無限細胞系,大多來自小鼠,如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等,均獲惡性,培養中呈巨噬細胞形態和吞噬功能,易于傳代和瓶壁分離,但難以建株。

培養巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞,以小鼠腹腔取材法最為實用,其法如下:

1、實驗前三天,向小鼠腹腔內注入無菌硫羥乙酸肉湯lml(勿注入腸內!),以刺流產生大量的巨噬細胞。

2、引頸處死小鼠。

3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3-5秒。

4、置動物于解剖臺,用針頭固定四肢,持鑷撕開腹部皮膚,但勿傷及腹膜壁,把皮膚拉向上下兩側,暴露出腹膜壁。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁,注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中,同時用手指從兩側壓揉腹膜壁,使液體在腹腔內流動。

6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側.使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內。

7、小心拔出針頭,把液體注入離心管。

8、4℃下250g離心10分鐘后,去上清,加10ml Eagle培養基。

9、計數細胞。每只鼠可產生20一30×106細胞,其中90%為巨噬細胞。

10、以3×105個貼附細胞/平方厘米接種。

11、接種數小時后,除去培養液,可去除其它白細胞,純化培養細胞,用Eagle液沖洗1一2次,再加新Eagle培養液置CO2溫箱中。

第六節 腎小球分離、移植培養

SD大鼠頸椎脫臼法處死,75%乙醇浸泡1~2分鐘,2次,置超凈臺內,打開腹腔取出腎臟剪碎,置含Hank's液的無菌培養皿洗滌,置80目不銹 鋼篩網上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產物微小組織透過篩網,濾過組織Hank's液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網,濾過,去小組織塊,濾過物吸至 200目不銹鋼篩網,輕輕濾過,Hank's液洗滌1次,收集網上腎小球,鏡下觀察為分離良好的腎小球。

腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶,37℃消化20分鐘,加血清終止胰酶反應,離心除去膠原酶。處理過的腎小球計數后接種至24孔培養板或25ml培養瓶,使腎小球大于60個/cm2, 加培養基5~10ml(培養基組成:F12—3T3上清1:1;5%馬血清;2.5%胎牛血清;胰島素5μg/ml;25ng/ml氫化可的松;5μg /ml轉鐵蛋白;25ng/ml前列腺素E1;甲狀腺素0.02ng/ml;D-纈氨酸150ng/ml)腎小球培養8~10天,去除腎小球未生長組分, 細胞繼續培養24小時,形態學觀察:細胞生長成單層多角型細胞,直徑約100μm。

第七節 裸小鼠移植瘤單細胞分離培養

無菌條件下取出小鼠移植瘤組織,剪成1mm3小塊,用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時,再加等體積0.2%胰酶消化5~8分鐘,在消化過程 中用吸管吹打組織塊或用自制裝置(分別作為加樣和收集器的兩個注射器中間加一小濾器連接而成,濾器中間墊兩層絲質材料以隔斷組織塊與單細胞)來回推動注射 器吹打組織以分離單細胞,終止酶消化方法同上。

常規方法接種培養收獲細胞。

第六章 腫瘤細胞的培養

腫瘤細胞在組織培養中占有核心的位置,首先癌細胞是比較容易培養的細胞。當前建立的細胞系中癌細胞系是最多的。另外腫瘤對人類是威脅最大的疾病。腫瘤細胞培養是研究癌變機理、抗癌藥檢測、癌分子生物學極其重要的手段。腫瘤細胞培養對闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用。

第一節 組織培養腫瘤細胞生物學特性

腫瘤細胞與體內正常細胞相比,不論在體內或在體外,在形態、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內的腫瘤細胞和在體外培養的腫瘤細胞,其差異較小,但也并非完全相同。培養中的腫瘤細胞具以下突出特點:

(一)形態和性狀

培養中癌細胞無光學顯微鏡下特異形態,大多數腫瘤細胞鏡下觀察比二倍體細胞清晰,核膜、核仁輪廓明顯,核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細胞表面的微絨毛多而細密,微絲走行不如正常細胞規則,可能與腫瘤細胞具有不定向運動和錨著不依賴性有關。

(二)生長增殖

腫瘤細胞在體內具有不受控增殖性,在體外培養中仍如此。正常二倍體細胞在體外培養中不加血清不能增殖,是因血清中含有很細胞增殖生長的因子,而癌細 胞在低血清中(2%~5%)仍能生長。已證明腫瘤細胞有自泌或內泌性產生促增殖因子能力。正常細胞發生轉化后,出現能在低血清培養基中生長的現象,已成為 檢測細胞惡變的一個指標。癌細胞或培養中發生惡性轉化后的單個細胞培養時,形成集落(克隆)的能力比正常細胞強。另外癌細胞增殖數量增多擴展時,接觸抑制 消除,細胞能相互重疊向三維空間發展,形成堆積物。

(三)永生性

永生性也稱不死性。在體外培養中表現為細胞可無限傳代而不凋亡(Apoptosis)。體外培養中的腫瘤細胞系或細胞株都表現有這種性狀,體內腫瘤 細胞是否如此尚無直接證明。因惡性腫瘤終將殺死宿主并同歸于盡,從而難以證明這一性狀的存在。體外腫癌細胞的永生性是否能反證它在體內時同樣如此?也尚難 肯定。從近年建立細胞系或株的過程說明,如果永生性是體內腫瘤細胞所固有的,腫瘤細胞應易于培養。事實上,多數腫瘤細胞初代培養時并不那么容易。生長增殖 并不旺盛;經過純化成單一化瘤細胞后,也大多增殖若干代后,便出現類似二倍體細胞培養中的停滯期。過此階段后才獲得永生性,順利傳代生長下去。從而說明體 外腫瘤細胞的永生性有可能是體外培養后獲得的。從一些具有永生性而無惡性性的細胞系,如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等細胞證明,永生性和惡性 (包括浸潤性)是兩種性狀,受不同基因調控,但卻有相關性。可能永生性是細胞惡變的階段。至少在體外是如此。

(四)浸潤性

浸潤性是腫瘤細胞擴張性增殖行為,培養癌細胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養時,能浸潤入其它組織細胞中,并有穿透人工隔膜生長的能力。

(五)異質性

所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態等性狀不同的細胞組成。異質性構成同一腫瘤內細胞的活力有差別的瘤組織;處于瘤體周邊區的細胞獲 得血液供應多,增殖旺盛,中心區有的細胞衰老退化,有的處于周期阻滯狀態,那些呈活躍增殖狀態的細胞稱干細胞(Stem  Cells)、只有這些干細胞才是支持腫瘤生長的成分。腫瘤干細胞培養時易于生長增殖;把干細胞分離出來的培養方法稱干細胞培養。

(六)細胞遺傳

大多數腫瘤細胞有遺傳學改變,如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細胞群常由多個細胞群組成,有干細胞系和數個亞系,并不斷進行著適應性演變。

(七)其它

腫瘤細胞在體外不易生長的原因可能由于:

①依賴性:腫瘤細胞雖有較強克隆生長力,但仍有一定的群體性或與其它細胞相依存關系。一是腫瘤細胞與腫瘤細胞的相互依存,二是腫瘤細胞與基質成纖維細胞的依賴。體外分散培養和排除成纖維細胞后也會同時消除或減弱這些依存關系,可能影響癌細胞增殖生長的活性;

②腫瘤細胞的自泌也會因分散培養而被稀釋,達不到腫瘤生長的需求,降低腫瘤細胞的生長增殖力;

③并非所有腫瘤細胞都有強的生長活力和長的Life Span,只有干細胞才有強的增殖生長能力,但這些細胞數量很少;

④離體培養腫瘤細胞可能需求與體內相似的特殊生存條件。

有細胞增殖,傳若干代后停止生長或衰退死亡;

傳數代后細胞增殖緩慢,經過一段停滯期后,才又呈旺盛生長狀態,形成穩定生長的腫瘤傳代細胞系。

以上現象說明腫瘤細胞對體外生存條件有較高的要求,并需經過對新環境的適應才能生長,因此欲獲得好的培養效果,不能局限于一般培養法,必須采用一些特殊的措施。

1、適宜底物:把經過純化的細胞接種在不同的底物上,如鼠尾膠原底層、飼細胞層等。

2、生長因子:應用促細胞生長因子,向培養液中增加一種或幾種促細胞生長因子。根據細胞種類不同選用不同的促生長物,常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。

為提高腫瘤細胞對體外培養環境的適應力和增加有活力癌細胞(干細胞)的數量,可采用動物體轉嫁接種成瘤后,再從動物體內取出進行培養,能提高體外培養的成功率。受體動物以裸鼠最好。

3、動物體媒介培養方法:

(1)瘤塊接種:取新鮮瘤組織,用Hanks液洗凈血污,切成1~3毫米小塊,用穿刺針頭吸一小瘤塊,用酒精棉球擦拭動物腹部后,直接刺入皮下,注入瘤塊;

(2)飼養觀察,待腫瘤生長達較大體積后,剝取出瘤組織;

(3)進行體外培養。

(4)為防止失敗,仍取部分瘤組織繼續在裸鼠體內傳代。通過裸鼠媒介接種,有活力的腫瘤細胞數量增多,細胞培養易于成功。

腫瘤細胞培養方法與培養正常細胞完全相同,但成功率比正常細胞高。


第二節 培養方法

腫瘤細胞培養成功關鍵在于:取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養液和培養底物等幾個方面。在具體培養方法方面,腫瘤細胞培養與正常組織細胞培養并無原則差別,初代培養應用組織塊和消化培養法均可。

1、取材:

人腫瘤細胞來自外科手術或活檢瘤組織。取材部位非常重要,體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區,取材時盡量避免用退變組織,要挑選活力較好的部位。癌性轉移淋巴結或胸腹水是好的培養材料。取材后宜盡快進行培養,如因故不能立即培養,可貯存于4℃中,但不宜栽過24小時。

2、培養基:

腫瘤細胞對培養基的要求不如正常細胞嚴格,一般常用的 RPMIl640、  DMEM、Mc-Coy5A等培養基等皆可用于腫瘤細胞培養。腫瘤細胞對血清的需求比正常細胞低,正常細胞培養不加血清不能生長,腫瘤細胞在低血清培養基 中也能生長。腫瘤細胞對培養環境適應性較大,是因腫瘤細胞有自泌(Autocrine)性產生促生長物質之故。但這并不說明腫瘤細胞完全不需要這些成分。 按不同細胞需要不同的生長因子;腫瘤細胞與正常細胞之間、腫瘤細胞與腫瘤細胞之間對生長因子的需求都存在著差異。但大多數腫瘤細胞培養中仍需要生長因子。 有的還需特異性生長因子〔如乳腺癌細胞等)。總之培養腫瘤細胞仍需加血清和相關生長因子培養更易成功。

3、成纖維細胞的排除:

成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長,致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快,最終能壓制腫瘤細胞的生長。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養中的關鍵。排除成纖維細胞有多種方法(表2-1)。

表2-1 抑制成纖維細胞生長因素
表2-1 抑制成纖維細胞生長因素


注:上表結果為個別實驗室經驗,僅供參考

第三節 成纖維細胞排除法

1、機械刮除法:

是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲)、或裹少許脫脂棉制成,裝入試管中高壓滅菌后備用(也可用特制電熱燒灼器刮除)。刮除程序為:

(1)標記:鏡下觀察,用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位;

(2)刮除:棄掉培養液,把無菌膠刮伸入瓶皿中,肉眼或顯微鏡窺視下,刮除無標記空間;

(3)用Hanks液沖洗一兩次,洗除被刮掉的細胞;

(4)注入培養液繼續培養,如發現仍有成纖維細胞殘留,可重復刮除至完全除掉為止

2、反復貼壁法:

根據腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點,并結合使用不加血清的營養液,把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁,使兩類細胞相互分離,操作方法與傳代相同。

(1)待細胞生長達一定數量后,倒出舊培養液,用胰酶消化后,Hanks 沖洗2次,加入不含血清的培養液,吹打制成細胞懸液;

(2)取編號為此A、B、C三個培養瓶;首先把懸液接種入A培養瓶中。置溫箱中靜止培養5~20分鐘后,輕輕傾斜培養瓶,讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養液,再接種入B培養瓶中后;向A瓶中補充少許完全培養液置溫箱中繼續培養;

(3)培養B瓶中細胞5~20分鐘后,接處理A的方法,把培養液注入C培養瓶中;再向B瓶中補加完全培養基。

當三個瓶內都含有培養液后,均在溫箱中繼續培養。如操作成功,次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞,B瓶兩類細胞相雜,C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復處理多次,直至癌細胞純化為止。

3、消化排除法:

此法曾用于乳癌細胞的培養,具體程序是:

(1)先是用0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培養細胞一次,然后再換成新的混合液繼續消化,并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養瓶,到半數細胞脫落下來后,便立即停止消化;

(2)把消化液吸入離心管中,離心去上清,吸入另瓶中,加培養液置溫箱中培養;向原瓶內也補加新的培養液繼續培養。用此法處理后,成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經過幾次反復處理,可能把成纖維細胞除凈。

4、膠原酶消化法:

本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點,通過消化進行選擇。

(1)可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理,邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視,當發現成纖維細胞被除掉后,即終止消化;

(2)用Hanks洗滌處理一次后,更換新培養液,繼續培養,可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈,可再次重復。

5、其它方法:

有人發現聚丙烯酰胺有抑制成纖維細胞生長的作用;也有人用聚蔗糖制備成比重1.025~1.085的密度梯度離心液,加入細胞懸液后,在23℃中 800g離心  10分種。在比重1.025~1.050層為成纖維細胞,在比重1.050~1.085層為上皮細胞,再經過分離進行培養。最近也有人應用特殊化學物如 SOD抑制成纖維細胞生長的方法。

選用上述任何一種方法,都需進行試驗,取得必要經驗,找出適合的條件,才能獲得好的效果。

第四節 提高腫瘤細胞培養存活率和生長率措施

根據人們的經驗,腫瘤細胞在體外不易培養,建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。當腫瘤組織或細胞初代接種培養后,常出現以下幾種情況:

完全無細胞游出或移動;

有細胞移動和游出,但無細胞增殖,細胞長時間處于停滯狀態以致難以傳代;

第五節 體外培養腫瘤細胞生物學檢測

一旦培養的腫瘤細胞生長成形態上單一的細胞群體或細胞系(或株)后,不論用于實驗研究還是建立細胞系,都需要做一系列的細胞生物學測定,主要的目的在于求得證明:

所培養的細胞系的確來源于原體內具有惡性的細胞,而非正常細胞或其它細胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學性狀。測定項目數量無明確規定,根據需要而定,以下為常做的項目和要點。

【形態觀察】主要觀察細胞的一般形態,如大體形態、核漿比例、染色質和核仁大小、多少等以及細胞骨架微絲微管的排列狀態等。

【細胞生長增殖】檢測細胞生長曲線、細胞分裂指數、倍增時間、細胞周期時間。

【細胞核型分析】檢測核型特點,染色體數量、標記染色體的有無、帶型等。

【凝集試驗】檢測凝集力。

【軟瓊脂培養】檢測集落形成能力。

【異體動物接種】向異體動物體內(皮下)接種細胞懸液,觀察成瘤能力。

【其它】除上述項目外,根據需要還可做同位素標記、組織化學成分分析,熒光顯微鏡觀察等。

在上述腫瘤細胞生物學檢測中,最主要的為:異體動物(以用裸鼠為上)接種成瘤、軟瓊脂培養、核型分析、細胞骨架和電鏡觀察等幾項。當然從分子細胞學角度考慮尚應做癌基因和抗癌基因等的檢測,這些項目將在本書第二篇中介紹。

第六節 對腫瘤細胞系或細胞株的評價

已建成的各種腫瘤細胞系或細胞株,無疑都是可用的實驗對象。近年我國已建成的腫瘤細胞系已非常多,并獲得越來越廣泛的應用。但根據研究者的經驗,在 使用這些細胞系時,應持特別審慎態度,主要是應考慮到這些細胞在長期傳代中有否發生遺傳性改變的可能。眾所周知,長期傳代細胞系染色體核型常是不穩定的。 另外也可能發生如基因突變、基因易位或缺失等變化。其結果可能導致細胞產生生物學性狀上的變動。以近年建成的各種腫瘤細胞系為例,都已傳代少則幾十,多則 百代以上后,才確認建成了細胞系。這種情況下很難保證細胞從初代到建成時的性狀仍是一致的。

已如前述,癌細胞在培養中并非能很順利地傳下去,凡已長期傳代的細胞系,都已獲得不死性。當前尚未完全確證所有癌細胞都具有不死性;因此尚難肯定在 長期培養中的癌細胞的生物學性狀與體內時仍完全相同(包括不死性)。據上述對用癌細胞系所獲實驗結果應盡量做分析性的結論,避免做概括性的與體內等同的結 論,外推與體內等同更是不妥的。廣泛來說,應用各種較長時間培養細胞做實驗時,都應如此。

文章來源:丁香通、網絡


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